primer5(在線設(shè)計(jì)引物) v5.0

primer5是一款由加拿大Premier公司推出的引物設(shè)計(jì)應(yīng)用軟件，可以方便專業(yè)的人員進(jìn)行PCR、測序引物、雜交探針的設(shè)計(jì)操作，集合了分為序列編輯窗口（genetank）、引物設(shè)計(jì)窗口（primer design）、酶切分析窗口（restriction sites）和紋基分析窗口（motif）、引物設(shè)計(jì)窗口、序列編輯窗口等，可以方便用戶快速得出引物分析的結(jié)果。此外，軟件還可以針對模板dna的來源以相應(yīng)的遺傳密碼規(guī)則轉(zhuǎn)換dna 和氨基酸序列，它有優(yōu)秀的引物自動搜索功能，同時(shí)可進(jìn)行部分指標(biāo)的分析，而且容易使用，已被引物設(shè)計(jì)行業(yè)人士認(rèn)為是一款相當(dāng)不錯(cuò)的軟件。如果你也需要它的幫助，那就快來下載收藏吧。

軟件功能介紹

1、軟件的主要功能分四種，即引物設(shè)計(jì)、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析、DNA 基元(motif)查找和同源性分析功能。前三種為其主要功能。此外，該軟件還有一些特殊功能，其中最重要的是設(shè)計(jì)簡并引物，另外還有序列"朗讀"、DNA 與蛋白序列的互換、語音提示鍵盤輸入等等。

2、還可以針對模板DNA 的來源以相應(yīng)的遺傳密碼規(guī)則轉(zhuǎn)換DNA 和氨基酸序列。軟件共給出八種生物亞結(jié)構(gòu)的不同遺傳密碼規(guī)則供用戶選擇，有纖毛蟲大核(Ciliate Macronuclear)、無脊椎動物線粒體(Invertebrate Mitochondrion)、支原體(Mycoplasma)、植物線粒體(Plant Mitochondrion)、原生動物線粒體(Protozoan Mitochondrion)、一般標(biāo)準(zhǔn)(Standard)、脊椎動物線粒體(Vertebrate Mito-chondrion)和酵母線粒體(Yeast Mitochondrion)。

軟件使用幫助

一、限制性酶切點(diǎn)分析及基元查找功能

1、其主要功能在主界面上一目了然。限制性酶切點(diǎn)分析及基元查找功能比較簡單，點(diǎn)擊該功能按鈕后，選擇相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶或基元(如-10 序列，-35 序列等)，按確定即可

2、常見的限制性內(nèi)切酶和基元一般都可以找到,你還可以編輯或者添加新限制性內(nèi)切酶或基元

二、引物設(shè)計(jì)

1、打開DNA序列后點(diǎn)擊按鈕primer，出現(xiàn)“search criteria”窗口，有多種參數(shù)可以調(diào)整

2、搜索目的(Seach For)有三種選項(xiàng)，PCR 引物(PCR Primers)、測序引物(Sequencing Primers)和雜交探針(Hybridization Probes)

3、搜索類型(Search Type)可選擇分別或同時(shí)查找上、下游引物(Sense/Anti-sense Primer，或Both)，或者成對查找(Pairs)，或者分別以適合上、下游引物為主(Compatible with Sense/Anti-sense Primer)。另外還可改變選擇區(qū)域(Search Ranges)，引物長度(Primer Length)，選擇方式(Search Mode)，參數(shù)選擇(Search Parameters)等等

4、使用者可根據(jù)自己的需要設(shè)定各項(xiàng)參數(shù)。如果沒有特殊要求，建議使用默認(rèn)設(shè)置。然后按search，隨之出現(xiàn)的Search Progress 窗口中顯示Search Completed 時(shí)，再按OK，這時(shí)搜索結(jié)果以表格的形式出現(xiàn)，有三種顯示方式，上游引物(Sense)，下游引物(Anti-sense)，成對顯示(Pairs)。默認(rèn)顯示為成對方式，并按優(yōu)劣次序(Rating)排列，滿分為100，即各指標(biāo)基本都能達(dá)標(biāo)

三、引物點(diǎn)擊

1、點(diǎn)擊其中一對引物，如第1#引物，并把上述窗口挪開或退出，顯示“Peimer Premier”主窗口，所得結(jié)果分三部分，

2、模板及產(chǎn)物位置，中間是所選的上下游引物的一些性質(zhì)，最下面是四種重要指標(biāo)的分析，包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)，二聚體(Dimer)，錯(cuò)誤引發(fā)情況(False Priming)，及上下游引物之間二聚體形成情況(Cross Dimer)

3、當(dāng)所分析的引物有這四種結(jié)構(gòu)的形成可能時(shí)，按鈕由變成，點(diǎn)擊該按鈕，在左下角的窗口中就會出現(xiàn)該結(jié)構(gòu)的形成情況

4、一對理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有，只有。值得注意的是中間一欄的末尾給出該引物的最佳退火溫度

四、引物修飾編輯

1、在需要對引物進(jìn)行修飾編輯時(shí)，如在5’端加入酶切位點(diǎn)，可點(diǎn)擊，然后修改引物序列

2、若要回到搜索結(jié)果中，則點(diǎn)擊按鈕。如果要設(shè)計(jì)簡并引物，只需根據(jù)源氨基酸序列的物種來源選擇前述的八種遺傳密碼規(guī)則，反推至DNA 序列即可

3、對簡并引物的分析不需像一般引物那樣嚴(yán)格

4、總之，“Premier”有優(yōu)秀的引物自動搜索功能，同時(shí)可進(jìn)行部分指標(biāo)的分析，而且容易使用，是一個(gè)相當(dāng)不錯(cuò)的軟件

primer5設(shè)計(jì)引物教程-primer5使用教程

獲得基因序列后，打開primer 5.0

點(diǎn)擊File-new-DNA sequence

粘貼cDNA序列-as is-ok

點(diǎn)primer

點(diǎn)search-調(diào)整如圖參數(shù)（產(chǎn)物長度一般為100-300，引物長度一般為20左右，視情況調(diào)整）

點(diǎn)ok，彈出的新窗口也點(diǎn)Ok

彈出下圖窗口后，先看右邊，根據(jù)系統(tǒng)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行篩選，優(yōu)先評分較高的

注：S是上游引物，A是下游引物，sense，anti-sense最好都是None，再細(xì)看

①ΔG絕對值小于10

②tm在58左右，正負(fù)2度

③GC%在40%-60%

④末端不能是A

⑤不能有連續(xù)3個(gè)相同的堿基

⑥3’端一定不能有錯(cuò)配

【篩選原則】：

1、最好hairpin, dimer, false priming 沒有

2、最好是沒有連續(xù)相同堿基，如TTT、GGG

3、最好兩個(gè)引物之間bp之差小于等于2，

4、產(chǎn)物長度大于100，小于300最好，也可以到400

5、tm在58左右，正負(fù)2度

6、一般設(shè)計(jì)時(shí)引物18-22長度，最長不要超過25

7、3’不能以A結(jié)尾

8、出現(xiàn)Found時(shí)，ΔG絕對值小于10

注：由于基因序列本身的差異，一般很難調(diào)到所有原則都滿足，但是可以對系統(tǒng)給出的引物中的前幾對進(jìn)行調(diào)整，盡可能滿足以上原則。

【如何調(diào)整】：

以系統(tǒng)給出的第一對引物為例（看框住的地方），雖然系統(tǒng)給出的評分比較高，但是下游引物可能出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）和二聚體（Dimer），我們可以嘗試調(diào)整一下。

首先點(diǎn)擊左上角的A（Anti-sense），當(dāng)圖示的引物與A的顏色一直時(shí)，表示展示的是Anti-sense，然后把鼠標(biāo)的光標(biāo)放在引物的位置左右滑動，調(diào)整上下游引物位置。

下圖是從3’往右移動了一個(gè)堿基，注意引物的長度會增加（只要是滑動了引物，改變了它的位置，長度就會增加，此時(shí)需要?jiǎng)h除多余的堿基，到合適的長度）

點(diǎn)擊Edit Primers，即可刪除多余的堿基

彈出如下窗口后，光標(biāo)點(diǎn)在①號位置，刪除幾個(gè)堿基后，

點(diǎn)擊②號位置Analyze,點(diǎn)擊③號位置ok

應(yīng)該刪除幾個(gè)堿基？滑動之后多了5個(gè)堿基，一般是刪除5個(gè)，但是下圖我刪除了6個(gè)，因?yàn)閯h除5個(gè)后末尾是A，我們在調(diào)整的時(shí)候可以多刪，也可以少刪，引物長度在合適范圍即可

注意編輯引物時(shí)，只能從右邊添加或刪除堿基，如果想在左邊添加或刪除需要通過左右移動堿基的位置。有時(shí)候評分不錯(cuò)的上下游引物也可以調(diào)整，以下圖為例，我想刪掉5’端的一個(gè)C，降低GC含量

首先把光標(biāo)放在引物的位置，將引物向后移動一個(gè)，看下圖可以觀察到引物向后移動了一個(gè)堿基，長度增加了，此時(shí)點(diǎn)擊Edit Primers。

刪除6個(gè)堿基后點(diǎn)擊Analyze（分析）（刪除幾個(gè)堿基視情況而定）

最后的結(jié)果

5' CACTGACTGCCAGAAGACC 3'

5' TACTCGTTCCAGGACCACC 3'

【如何導(dǎo)出？先打開一個(gè)Excel文件】

點(diǎn)擊Edit-copy-sense primer-粘貼

點(diǎn)擊Edit-copy-Anti sense primer-粘貼

總結(jié)：根據(jù)系統(tǒng)給出的評分，看前幾對引物是否是理想的引物，大部分情況不會都滿足上述原則，需對前幾對進(jìn)行調(diào)整。（三步結(jié)合使用）

一：刪除或添加末端堿基

二：拖動堿基的位置，向前移動一個(gè)或多個(gè)堿基或向后移動一個(gè)或多個(gè)堿基

三：點(diǎn)擊Edit Primers，刪除幾個(gè)堿基后分析

終極大法：有時(shí)候調(diào)整了也達(dá)不到理想的效果，嘗試耐著性子調(diào)整第一對，實(shí)在調(diào)不了，直接用第一對。

注：Win10系統(tǒng)使用時(shí)將輸入法切換為英文，防止軟件彈出。

軟件特色

病理檢測引物設(shè)計(jì)：可以用在高保區(qū)域設(shè)計(jì)引物

等位基因特效引物：設(shè)計(jì)專用于擴(kuò)增某一類相關(guān)序列中特定成員的引物

種間交叉引物設(shè)計(jì)：利用來自多個(gè)物種的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物